Caracterización y diferenciación in vitro de células germinales de testículo de ratón

Abstract

El propósito principal de cualquier organismo con reproducción sexual es pasar sus genes a la siguiente generación vía sus células germinales, en vista de ello es necesario solventar los problemas que se pueden presentar en el momento de la reproducción por el daño o poca funcionalidad de este tipo celular; estos problemas pueden tener origen tanto en el género femenino como en el masculino, teniendo menor porcentaje de exclusividad en este último según la Organización Mundial para la Salud, por lo que estudios que contribuyen a resolver los problemas generados por el género masculino son escasos. En tal sentido, el objetivo de esta investigación es caracterizar y diferenciar las células germinales de testículo de ratón hacia diferentes estadios de la espermatogénesis, en condiciones in vitro. La espermatogénesis, es el proceso mediante el cual se logra la formación de espermatozoides maduros capaces de fecundar un óvulo; este proceso comienza con las células madre espermatogénicas, que son una población de células madre adultas con capacidad de autorenovarse indefinidamente y de producir células progenies productoras de espermatozoides a lo largo de la vida del individuo. La diferenciación in vitro de las células germinales dependerá del uso de factores solubles adicionados a los medios de cultivo, como el factor de células madre (SCF) comúnmente utilizado para la diferenciación de este tipo celular; y a los propios sistemas de cultivo empleados como los cultivos en monocapa y los sistemas tridimensionales, los cuales consisten en proporcionarle a las células las condiciones in vivo. Los cultivos primarios de las células de testículo de ratón recién destetado muestran una población heterogénea formada por: células espermatogonias, espermatocitos, células de Sertoli y células mioides peritubulares, estas poblaciones lograron mantenerse a lo largo de los subcultivos. Por medio de coloraciones de rutinas e histoquímicas realizadas en diversos cultivos, se pudo evidenciar la presencia de células espermatogénicas PAS positivas y marcadas con la Lectina DBA, como las espermatogonias presentando una morfología redondeada, el núcleo ovoide prominente y escaso citoplasma, y los espermatocitos con una morfología similar a las espermatogonias pero con mayor proporción del citoplasma. Además, se observó la presencia de células de Sertoli con extensiones citoplasmáticas y de células mioides peritubulares con una morfología alargada tipo fibroblasto. Gracias a la determinación inmunohistoquímica se pudo apreciar la expresión Vimentina en las células de Sertoli. Los cultivos en monocapa sometidos a la inducción así como en los controles, mostraron una diferenciación hacia espermátidas, observándose un serie de cambios morfológicos que van desde morfologías redondeadas característica de las espermatogonias tempranas, a una morfología alargada donde el núcleo esta desplazado hacia un extremo y muy cercano a él se aprecia un a vacuola que se asemeja a la vesícula acrosomal y en el otro extremo el citoplasma extendido; estas células se marcaron con la Lectina DBA y reaccionaron positivamente al PAS. En las matrices tridimensionales sometidas a la inducción se aprecio, en algunas zonas la presencia de estructuras ramificadas, lo que podría indicar la diferenciación hacia otro linaje celular. Además se criopreservaron las células por dos metodología distintas, obteniéndose un alto porcentaje de viabilidad en ambos caso, 86% por el método de vitrificación y 68% por el método convencional utilizando glicerol al 10% como crioprotector, sin embargo se observó poca adherencia de las células luego del proceso de criopreservación. Según los diferentes resultados obtenidos se puede sugerir la importancia de la presencia de las células de Sertoli en los diferentes sistemas de cultivos estudiados, para el mantenimiento, proliferación, adhesión y diferenciación de las células germinales hacia su propio linaje in vitro.