Establecimiento del cultivo de células madre mesenquimales de la membrana amniótica de fetos de ratón. Caracterización y diferenciación in vitro.

Abstract

En los últimos años, ha surgido un nuevo campo de la medicina y la biología que está íntimamente ligado al conocimiento y el desarrollo histológico, el cual se conoce con el nombre de bioingeniería de tejidos. Para conseguir su objetivo de regenerar, restablecer o simular la función normal de un tejido mediante la utilización de células que son cultivadas en el laboratorio, la ingeniería tisular necesita una fuente adecuada de estas que sean funcionales y viables, así como biomateriales y señales moleculares de distintas naturaleza. Uno de los ámbitos de la medicina del futuro que más expectativas ha despertado en los últimos años es la investigación con células madre. El aislamiento de células madre embrionarias, la aparente e inesperada potencialidad de las células madre adultas y el desarrollo de la bioingeniería de tejidos, ha llevado a imaginar un porvenir esperanzador para un importante número de estudios básicos, clínicos y terapéuticos. Las actuales fuentes de obtención de estas células plantean muchos problemas, tanto éticos como técnicos. El hallazgo de otras opciones que no acarreen dichos inconvenientes, sea de fácil acceso sin que suponga ningún riesgo para el donante y provean un material suficiente y numeroso; han proporcionado grandes progresos en este ámbito. Una nueva fuente que cumple con todos estos requisitos es la membrana amniótica fetal, la cual es un tejido descartable, rico en células madre mesenquimales. Estas células son células que no presentan mutaciones somáticas y son inmaduras desde el punto de vista inmunológico, favoreciendo la compatibilidad. La membrana amniótica representa la porción más interna de las membranas extraembrionarias y se compone de una sola capa de células epiteliales, una membrana basal gruesa y un estroma avascular. Desde que sus células fueron descritas se ha estudiado su caracterización fenotípica, ontogénica y funcional; sin embargo, aún quedan numerosos aspectos por dilucidar sobre su biología, especialmente en lo relacionado con su funcionalidad ya que ésta puede variar en respuesta a señales presentes en nichos o microambientes particulares in vitro, dependiendo de la interacción directa con otras células o de la liberación de factores solubles y de crecimiento. Los estudios realizados con este tipo de células troncales son escasos, e inexistentes en nuestro país, por lo que en el presente trabajo se expondrá el desarrollo de un proyecto de investigación sobre el aislamiento, establecimiento, caracterización y diferenciación in vitro de células provenientes del estroma de la membrana amniótica de fetos de ratón. Se evaluó si estas células mantienen su funcionalidad y viabilidad bajo ciertas condiciones de cultivo, expresan características propias fenotípicas y bioquímicas de células madre mesenquimales y pueden ser canalizadas hacia linajes de origen mesodérmico. Los cultivos primarios en monocapa de las células aisladas de la membrana amniótica de fetos de ratón, obtenidos por explantes y disgregación enzimática con tripsina – colagenasa tipo V, mostraron una heterogeneidad caracterizada por dos tipos principales de fenotipos celulares: una población de células con morfología fusiforme y una con amplio volumen citoplasmático, considerándose la segunda como una subpoblación de la primera. Los subcultivos celulares permitieron la obtención de una población celular más homogénea, persistiendo mayoritariamente las células con morfología ahusada. La proliferación de cada cultivo fue diferencial, pero un ensayo para evaluar este parámetro determinó que los cultivos primarios y subcultivos posteriores mostraron el comportamiento típico de las células mantenidas in vitro, caracterizado por tres fases, con lo que se definió el comienzo de la fase de crecimiento exponencial, sin llegar a observarse una fase de senescencia o muerte. Por medio de ensayos de caracterización morfológica e inmunocitoquímica, se pudo evidenciar la obtención de células con características de células troncales de naturaleza mesenquimal, las cuales presentaron expresión de Vimentina y Stro-1 e inexpresión de antígenos de histocompatibilidad H2. Las células cultivadas en monocapa sometidas a ensayos de inducción, mostraron diferenciación hacia linaje osteogénico, condrogénico y adipogénico lo cual se determinó mediante coloraciones histoquímicas con Rojo Alizarina S, Safranina O, Azul de Toluidina, Azul Alcian y Sudan III. Se observó la expresión de fenotipos celulares particulares y la deposición de componentes de matriz extracelular, intensificándose esto a medida que se inducía por más tiempo. Estos resultados indican la importancia del contacto célula – célula, célula – matriz y la acción de factores solubles específicos para el mantenimiento de las células, estimulación de su proliferación y biosíntesis de matriz.