Una Contribución al Estudio de la Ca2 -ATPasa de Membrana Plasmática de Humanos y Proteínas Reguladoras de Calcio de Trypanosoma evansi.

Abstract

Estudios recientes han demostrado la estimulación de diferentes isoformas de la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática (PMCA) por parte del etanol (EtOH) y de segundos mensajeros de origen lipídico, los cuales presentan en su estructura molecular un grupo hidroxilo libre, como el diacilglicerol (DAG) y la ceramida. Dicha estimulación ha sido estudiada, tanto en la enzima purificada como en fragmentos de membrana, observándose en todos los casos, aditividad con la estimulación inducida por la calmodulina (CaM), principal modulador de la PMCA. En la primera parte de este trabajo, nos propusimos profundizar en la caracterización del posible sitio de acción del EtOH y sugerir los potenciales mecanismos de acción del DAG y la ceramida, sobre la enzima. Trabajos previos realizados en el laboratorio permitieron establecer una región de interacción del EtOH con la PMCA situada en el extremo C-terminal de la enzima, cerca del dominio de unión de la CaM. Dicho resultado se obtuvo gracias a la sobreexpresión de formas truncadas de la PMCA4b de humanos. En este trabajo nos propusimos ahondar en el estudio del sitio de interacción descrito con la finalidad de acotar la región de interacción del EtOH con la enzima. Asimismo, nos propusimos caracterizar si la región de interacción del EtOH es la misma región involucrada para el DAG y la ceramida. Para ello, se expresó una forma truncada intermedia a las previamente utilizadas, como es la hPMCA4b Δ118, para estudiar el efecto del EtOH, el DAG y la ceramida en esta proteína. Nuestros, resultados nos permiten sugerir una región de 74 aa como el posible dominio de interacción del EtOH con la enzima. Así mismo, sugerir mecanismos de acción diferentes al del EtOH para el DAG y la ceramida, compuestos que estimularon todas las formas truncadas usadas en este trabajo y mostraron aditividad con el EtOH. La segunda parte de este trabajo estuvo dirigida a evidenciar de manera fisiológica, molecular, inmunológica y bioquímica las proteínas involucradas en la homeostasis de Ca2+ en Trypanosoma evansi y compararlas con las descritas en otros tripanosomatidios y en eucariotas superiores, con el fin de establecer posibles diferencias que puedan ser utilizadas como potenciales blancos para la generación de drogas tripanocidas. La suma de las diferentes aproximaciones experimentales utilizadas, nos permitieron sugerir en T. evansi, la presencia de tres Ca2+-ATPasa, las cuales presentan 10 dominios transmembrana y los 3 dominios característicos para estas enzimas, de unión a Ca2+, ATP y de fosforilación. Estas fueron identificadas como: Una Ca2+-ATPasa tipo PMCA, contentiva de un dominio no clásico de unión a CaM en el extremo C-terminal de la enzima, reconocida por anticuerpos monoclonales específicos para PMCA de Homo sapiens y de peso molecular similar al de sus homólogas en otros tripanosomatidios y eucariotas superiores. Una Ca2+-ATPasa tipo vacuolar, carente del dominio de unión a CaM y una Ca2+-ATPasa tipo SERCA, sensible a tapsigargina (Tg) y benzoquinonas (BHQ), la cual también es reconocida por anticuerpos específicos dirigidos contra SERCA de eucariotas superiores. Por otra parte, en este trabajo identificamos por primera vez en T. evansi, la presencia de canales de Ca2+ sensibles a 2APB, así como una secuencia aminoacídica que comparte homología con la subunidad α de canales de Ca2+ voltaje dependiente. Los resultados obtenidos en esta parte de nuestro trabajo, permiten establecer un modelo con los principales mecanismos de regulación de los niveles de Ca2+ intracelular en T. evansi, así como establecer diferencias entre los mecanismos reportados para otros tripanosomatidios y eucariotas superiores.