Aislamiento y caracterización de microorganismos entomopatógenos y su empleo como agentes de biocontrol de Hylesia Metabus cramer (Lepidoptera: Saturniidae)

Abstract

Resumen Hylesia metabus es una polilla de la familia Saturniidae conocida en la región Nororiental de Venezuela como \la Palometa Peluda". Este lepidóptero se considera un problema de salud pública en esta región debido a la dermatitis producida por las setas urticantes que cubren el cuerpo de la hembra adulta de este insecto y que son liberadas durante el vuelo. Como un aporte a la salud pública de la región Nororiental de Venezuela, y en la búsqueda de agentes para el control biológico de esta plaga, en el presente trabajo se plante ó aislar selectivamente cepas de Bacillus thuringiensis y hongos entomopatógenos que puedan ser usados como potenciales biocontroladores de Hylesia metabus en su fase larval.En este sentido, se han obtenido 14 cepas autóctonas de B. thuringiensis, provenientes de muestras de suelo y de larvas muertas de H. metabus, con las cuales se creó un banco de cepas en el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM). Dichas cepas han sido caracterizadas bioquímica y molecularmente, obteniendo que 2 ellas, aisladas de larvas muertas de H. metabus, presentaron al gen cry1 (CVCM1813 y CVCM1814). Por su parte, el patrón de proteínas sirvió para confirmar que la cepa CVCM1814 sintetiza la proteína Cry1, codi cada por gen cry1. Las cepas CVCM2183, CVCM1863 y CVCM1830,mostraron la banda de 130 KDa correspondiente a la proteína Cry1, a pesar de dar negativas en la PCR. Con la nalidad de caracterizar a los cristales, se realizó un método basado en las interacciones apolares de las esporas para obtener fracciones de cristales. A través de microscopía electrónica de barrido se mostró que las cepas CVCM1814 y CVCM2183, tienen cristales de tamaño similar a los de la cepa control CVCM1819. Seguidamente,las cepas de B. thuringiensis fueron caracterizadas por ribotipi cación, lo que permitió la categorización de 11 cepas como pertenecientes a ribogrupos de B. thu-ringiensis con altos índices de similitud. Finalmente, se llevaron a cabo bioensayos con larvas sanas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) con el n de evaluar la toxicidad de los distintos aislados, sin resultados satisfactorios. En miras al diseño de un medio de cultivo para la masifi cación de las cepas bacterianas de interés surgidas de este estudio, se utilizaron como constituyentes los subproductos agroindustriales melaza, Concentran 21r y vinaza, los cuales son de fácil adquisición y de bajos costos. Todos los medios que contenían vinaza como fuentes de sales (S1 y de la matriz multifactorial) no promovieron el crecimiento de B. thuringiensis. Por su parte, la formulación de los medios de cultivo MC1, MC2, MC3 y MC4, a partir de los subproductos agroindustriales, melaza y Concentración 21r, permitieron el crecimiento adecuado de B. thuringiensis. En dichos medios fue posible el cálculo de parámetros cinéticos, como los tiempos generacionales de la bacteria, obteniendo que dichos parámetros mostraron valores menores en los medios suplementados con sales (MC1, MC4 y Control-A80) con respecto a los obtenidos en los medios sin sales (MC2 y MC3). Al nal de la incubación, todos los medios arrojaron contajes de esporas en fase estacionaria por encima de 10 8 UFC/mL. Tomando en cuenta dichos resultados, se realizó el análisis de la vinaza y seguidamente se pudieron comparar los medio S1 y A80 en cuanto al aporte de sales y elementos, destacándose que la vinaza tiene muy altas concentraciones de potasio y muy bajas concentraciones de sulfatos y fosfatos. Luego, se realizó el método de difusión en disco como una herramienta que mostró que la vinaza inhibía el crecimiento de B. thuringiensis cuando se encontraba a la misma concentración que en el medio S1 (20% v/v). Por otro lado, se aislaron dos hongos, en condiciones epizoóticas, sobre cadáveres de larvas y pupas de H. metabus. Los mismos fueron identi cados por parámetros morfológicos y moleculares como Beauveria bassiana. Con estos hongos se realizaron bioensayos para evaluar sus actividades entomopatog énicas en condiciones de laboratorio con larvas sanas de H. metabus. Los aislados fúngicos causaron mortalidades signi cativas sobre H. metabus, con porcentajes de 80 y 65 %, respectivamente. Los resultados obtenidos constituyen la primera evidencia de un hongo entomopatógeno asociado a Hylesia metabus. Las implicaciones de estos hallazgos van más allá de una simple identi cación del agente causal de una enfermedad sobre un insecto. Así, se abre la posibilidad de aportar una nueva forma de control de esta importante plaga de salud pública.